بیماریهای ژنتیکی هنوز یک چالش جهانی هستند، زیرا ناشی از جهشهایی در ژنها هستند که بر عملکردهای بیولوژیکی، فرآیندهای متابولیک یا تولید پروتئینهای ضروری خاص افراد تأثیر میگذارند و منجر به اختلالات ارثی مختلف میشوند. داروهای ژن درمانی نوعی مداخله درمانی هستند که ژنهای خاصی را هدف قرار میدهند، با هدف ترمیم یا اصلاح آنها و ارائه دستورالعملهای جدید برای سلولها برای تولید پروتئینهای عملکردی یا مداخله در نقصهای ژنی که باعث بیماری میشوند.
داروهای ژنی رایج عمدتاً شامل DNA و RNA هستند که DNA میتواند قطعات ژنی یا توالیهای ژنی با اثرات درمانی باشد. این DNA برای جایگزینی یا تکمیل عملکرد ژن معیوب یا از دست رفته به سلول ها تحویل داده می شود. RNA می تواند RNA پیام رسان (mRNA)، RNA مداخله گر کوچک (siRNA)، یا الیگونوکلئوتیدهای ضد حس (ASO) و غیره باشد که می تواند برای اصلاح، مهار بیان ژن های مضر یا بازیابی عملکرد ژن های خاص مورد استفاده قرار گیرد.
با این حال، DNA و RNA هر دو با چالشهای زیادی از ورود به بدن انسان تا رسیدن به سلولهای هدف مواجه هستند. از آنجایی که توالیهای ژنی در دستگاه گوارش ناپایدار هستند، معمولاً با تزریق داخل وریدی یا زیر جلدی تجویز میشوند، اما با این وجود، بیشتر توالیهای ژنی هنوز توسط نوکلئازهای فراوان در بدن انسان تجزیه میشوند.
وقتی مقدار کمی از داروهای ژنی باقیمانده به خارج از سلولهای هدف میرسد، نمیتوانند وارد سلولها شوند، زیرا توالیهای ژن مولکولهای بزرگی هستند که گروههای فسفات حامل بارهای منفی هستند، در حالی که غشای سلولی نیز حامل بارهای منفی هستند. وقتی دو بار منفی به هم می رسند، ژن ها دفع می شوند و نمی توانند وارد سلول ها شوند. بنابراین، ما باید روشهای انتقال داروی ژنی را توسعه دهیم تا از تخریب آنها در داخل بدن جلوگیری کنیم و کارایی نفوذ غشای سلولی را بهبود ببخشیم و توالیهای DNA یا RNA را به طور روان به سلولها برسانیم.
روش های تحویل برای داروهای ژنی
روشهای رایج انتقال ژن به دو دسته تقسیم میشوند: تحویل ناقل ویروسی و تحویل ناقل غیر ویروسی. تحویل ناقل ویروسی عمدتاً شامل ویروس مرتبط با آدنو (AAV) و لنتی ویروس و غیره است که میتواند فرآیند عفونت ویروسی سلولهای میزبان را شبیهسازی کند و به راحتی از موانع سلولی عبور کند و در نتیجه به راندمان انتقال بالایی دست یابد. با این حال، تحویل ناقل ویروسی نیز مشکلاتی دارد: اول، ظرفیت بستهبندی محدودی دارد، مانند حداکثر ظرفیت بستهبندی AAV 4.7 کیلوبایت، که نمیتواند توالیهای ژنی طولانیتری را تحویل دهد. ثانیا، ناقل های ویروسی ممکن است باعث واکنش های ایمنی جدی، از جمله ایمنی سلولی و ایمنی هومورال شوند که خطراتی را برای کاربردهای بالینی ایجاد می کند. در مقایسه با آن، ناقلهای غیر ویروسی مزایای زیادی در ایمنی و ظرفیت بارگیری دارو دارند.
ناقلهای غیر ویروسی رایج کنونی عمدتاً شامل لیپوزومها، پلیمرها، نانوذرات، اگزوزومها و غیره میباشند که در میان آنها لیپوزومها وزیکولهایی هستند که توسط مولکولهای آمفیفیلیک با قطرهای 100 نانومتر تا 1um تشکیل شدهاند. آنها عمدتاً از فسفولیپیدها، کلسترول، لیپیدهای PEG و لیپیدهای کاتیونی تشکیل شده اند. ساختار دولایه فسفولیپیدی شبیه به غشای سلولی است و می تواند به راحتی از طریق اندوسیتوز وارد سلول ها شود. علاوه بر این، لیپوزومها همچنین میتوانند PEG یا آنتیبادیهای خاص را بر روی سطوح خود تغییر دهند تا در عین حال بافتها یا سلولهای خاص را هدف قرار دهند. لیپوزوم های کاتیونی لیپوزوم هایی هستند که حاوی لیپیدهای نمک آمونیوم چهارتایی با بار مثبت هستند که بهتر می توانند با داروهای اسید نوکلئیک با بار منفی متصل شوند و پایداری سیستم تحویل را حفظ کنند. بنابراین، لیپوزومها یکی از روشهای رایج انتقال ناقل غیر ویروسی برای داروهای ژنی هستند.
با این حال، لیپوزومهای سنتی مشکلاتی نیز دارند: اول از همه، به دلیل دهانه بزرگ قطر لیپوزوم، اگرچه این میتواند ظرفیت بارگیری دارو کافی را تضمین کند، زمانی که لیپوزومها از شکاف اندوتلیال عروقی (100-200nm)، خیلی بزرگ عبور میکنند. اندازه مانع این روند خواهد شد. علاوه بر این، پس از اینکه لیپوزوم ها از طریق اندوسیتوز وارد سلول ها می شوند و سیستم اندوزوم-لیزوزوم را تشکیل می دهند، لیپوزوم های سنتی نمی توانند به موقع لیزوزومی را کامل کنند و در نتیجه اکثر داروهای ژنی توسط لیزوزوم ها تجزیه می شوند و قادر به اعمال اثرات خود نیستند. بر اساس این کاستیهای لیپوزومهای سنتی در انتقال داروهای ژنی، نانوذرات لیپیدی (LNP) توسعه یافتهاند و به یک روش انتقال مهم به ویژه برای رساندن اسیدهای نوکلئیک به سلولها و بافتهای هدف تبدیل شدهاند.
مقدمه ای بر سیستم حامل LNP
نانوذرات لیپیدی (LNP) نانوذراتی هستند که از مواد لیپید مانند و قطری معمولاً بین 10-200 نانومتر تشکیل شدهاند. در مقایسه با لیپوزوم های سنتی، آنها کوچکتر هستند و راحت تر از شکاف های اندوتلیال عروقی عبور می کنند. علاوه بر این، LNP معمولاً از لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون، فسفولیپیدهای کمکی، لیپیدهای پلی اتیلن گلیکول (PEG) و کلسترول تشکیل شده است. در میان آنها، فسفولیپیدهای کمکی و کلسترول می توانند پایداری LNP را افزایش دهند. لیپیدهای PEG به افزایش زمان گردش LNP در داخل بدن و کاهش واکنش های ایمنی کمک می کنند. این اجزا عملکردی مشابه لیپوزوم های سنتی دارند. تفاوت در لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون نهفته است، که همچنین منطقه اصلی حفاظت از ثبت اختراع برای LNP است.
همانطور که قبلا ذکر شد، لیپوزوم های کاتیونی می توانند به طور موثری اتصال با داروهای اسید نوکلئیک را حفظ کرده و کارایی تحویل داروهای اسید نوکلئیک را بهبود بخشند. با این حال، لیپوزومهای کاتیونی نیز مستعد اتصال غیر اختصاصی با پروتئینهای پلاسما با بار منفی، سلولهای خونی و غیره در گردش خون هستند که باعث تجمع لیپوزومها شده و به سرعت از بدن پاک میشوند (نیمه عمر لیپوزومهای کاتیونی در داخل بدن است. فقط 15 دقیقه).
برای حل این مشکل، محققان نوع جدیدی از مواد لیپیدی را به نام لیپیدهای یونیزاسیون ابداع کرده اند. لیپیدهای قابل یونیزاسیون از نظر ساختار بسیار شبیه به لیپیدهای کاتیونی هستند. با در نظر گرفتن لیپید کاتیونی رایج DOTAP و لیپید قابل یونیزاسیون DODAP، تفاوت این است که DOTAP یک نمک آمونیوم چهارتایی با بار مثبت است، در حالی که DODAP یک ساختار آمین سوم است. ساختار آمین سوم می تواند pKa لیپید را بین 6-7 نگه دارد. هنگامی که PH کمتر از pKa باشد (در شرایط اسیدی)، لیپیدهای یونیزاسیون بار مثبت دارند.
هنگامی که PH نزدیک به pKa است (در شرایط خنثی)، لیپیدهای یونیزاسیون خنثی هستند. این طرح می تواند به طور هوشمندانه مشکل لیپوزوم های کاتیونی را حل کند: از آنجایی که PH در گردش خون نزدیک به خنثی است، لیپیدهای قابل یونیزاسیون نیز خنثی هستند و اتصال غیر اختصاصی بین آنها و پروتئین های پلاسما یا سلول های خونی به طور قابل توجهی کاهش می یابد و نصف آن افزایش می یابد. -زندگی علاوه بر این، هنگامی که LNP لیپید قابل یونیزاسیون توسط سلول ها جذب می شود و وارد لیزوزوم می شود، لیپیدها یونیزه می شوند و در محیط لیزوزومی با pH 5-6 دارای بار مثبت می شوند. لیپیدهای دارای بار مثبت به راحتی با غشای اندوزوم - لیزوزوم ترکیب می شوند و به لیپوزوم ها اجازه می دهند به سیتوپلاسم فرار کنند، اسیدهای نوکلئیک را تجزیه و آزاد کنند و در نتیجه اثرات خود را اعمال کنند. به طور خلاصه، طراحی سیستم حامل LNP شامل بهینه سازی ترکیب لیپید، اندازه ذرات، بار سطحی و پایداری برای دستیابی به تحویل ژن کارآمد است.
استراتژی بیوآنالیز LCMS برای داروهای ژنی بسته بندی شده با LNP
داروهای ژنی بسته بندی شده با LNP عمدتاً از پوسته LNP و خود داروی ژنی تشکیل شده است. پوسته LNP عمدتاً از اجزای لیپیدی تشکیل شده است (لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون حدود 30-50٪، لیپیدهای PEG حدود 2٪، کلسترول حدود 20-50)، فسفولیپیدهای کمکی حدود {{4 را تشکیل می دهند. }}٪، در حالی که داروهای ژنی عمدتاً از قطعات توالی ژن (DNA، ASO، siRNA و miRNA و غیره) تشکیل شده اند. طبق آخرین مقررات NMPA و FDA[14-15]، برای کاربرد IND داروهای سیستم تحویل دارو مانند LNP، علاوه بر انجام مطالعات فارماکولوژیک و فارماکوکینتیک بر روی ماده فعال (توالی ژن)، ایمنی و ارزیابی دارویی همچنین برای اجزای لیپیدی جدیدی که در داروهای عرضهشده در سیستم دارورسانی استفاده نشدهاند، مانند لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیونپذیر و چربیهای PEG با تغییرات ویژه در LNP مورد نیاز هستند.
تجزیه و تحلیل زیستی LCMS لیپیدهای LNP بر روی لیپیدهای کاتیونی/یونیزپذیر و لیپیدهای PEG تمرکز دارد. با توجه به تفاوتهای ساختاری بین آنها، وزن مولکولی لیپید کاتیونی/یونیزاسیونپذیر عموماً در محدوده 1 کیلو دالتون است، در حالی که وزن مولکولی لیپیدی PEG میتواند پس از حمل گروههای اصلاحی به 2 تا 5 کیلو دالتون برسد و در نتیجه تفاوتهای زیادی در حفظ کروماتوگرافی و پاسخ طیفسنجی جرمی بین آنها ایجاد میشود. با توجه به اینکه محتوای لیپید کاتیونی/یونیزاسیون در LNP بیشتر از لیپید PEG است، تفاوت پاسخ منجر به ناتوانی در یکسان سازی موثر روش های پیش تصفیه (انتخاب حلال استخراج، تعیین فاکتور رقت) هر دو می شود. علاوه بر این، به دلیل وجود بسیاری از پیک های تداخلی در اطراف موقعیت پیک لیپید PEG، یک گرادیان جداسازی فاز مایع طولانی تر اغلب برای جداسازی موثر مورد نیاز است که نمی تواند کارایی تجزیه و تحلیل بالا را تضمین کند. بنابراین، ما به طور جداگانه روش تشخیص لیپید PEG را در بیوانالیز ایجاد می کنیم. در عین حال، لیپید کاتیونی/یونیزاسیون و لیپید PEG نیز به دلیل اجزای لیپیدی خود، مشکلات رایجی در توسعه روش دارند، مانند حلالیت ضعیف در آب، ناپایداری در ماتریکس بیولوژیکی، اتصال پروتئین منجر به بازیابی بیش از حد، تداخل زیاد و باقیمانده لیپید PEG، تغییر پایداری لیپید در ماتریس نمونه واقعی و مشکل در انتخاب استاندارد داخلی.
