بیماری‌های ژنتیکی هنوز یک چالش جهانی هستند، زیرا ناشی از جهش‌هایی در ژن‌ها هستند که بر عملکردهای بیولوژیکی، فرآیندهای متابولیک یا تولید پروتئین‌های ضروری خاص افراد تأثیر می‌گذارند و به اختلالات ارثی مختلف می‌پردازند. داروهای ژن درمانی نوعی مداخله درمانی هستند که ژن‌های خاصی را هدف قرار می‌دهند، با هدف ترمیم یا اصلاح آنها و ارائه دستورالعمل‌های جدید برای سلول‌ها برای تولید پروتئین‌های عملکردی یا مداخله در نقص‌های ژنی که باعث بیماری می‌شوند.
داروهای ژنی رایج عمدتاً شامل DNA و RNA هستند که DNA می‌تواند قطعات ژنی یا توالی‌های ژنی با اثرات درمانی باشد. این DNA برای جایگزینی یا تکمیل عملکرد ژن معیوب یا از دست رفته به سلول ها تحویل داده می شود. RNA می تواند RNA پیام رسان (mRNA)، RNA مداخله گر کوچک (siRNA)، یا الیگونوکلئوتیدهای ضد حس (ASO) و غیره باشد که می تواند برای اصلاح، مهار بیان ژن های مضر یا بازیابی عملکرد ژن های خاص مورد استفاده قرار گیرد.
با این حال، DNA و RNA هر دو با چالش‌های زیادی از ورود به بدن انسان تا رسیدن به سلول‌های هدف مواجه هستند. از آنجایی که توالی‌های ژنی در دستگاه گوارش ناپایدار هستند، معمولاً با تزریق داخل وریدی یا زیر جلدی تجویز می‌شوند، اما با این وجود، بیشتر توالی‌های ژنی هنوز توسط نوکلئازهای فراوان در بدن انسان تجزیه می‌شوند.
هنگامی که مقدار کمی از داروهای ژن باقیمانده به خارج از سلول های هدف می رسد، نمی توانند وارد سلول ها شوند زیرا توالی های ژنی مولکول های بزرگی هستند که گروه های فسفات حامل بارهای منفی هستند، در حالی که غشای سلولی نیز حامل بارهای منفی هستند. وقتی دو بار منفی به هم می رسند، ژن ها دفع می شوند و نمی توانند وارد سلول ها شوند. بنابراین، ما نیاز به توسعه روش‌های انتقال داروی ژنی داریم تا از تخریب آنها در داخل بدن جلوگیری کنیم و کارایی نفوذ غشای سلولی را بهبود بخشیم و توالی‌های DNA یا RNA را به طور روان به سلول‌ها برسانیم.
روش های تحویل برای داروهای ژنی
روش‌های رایج انتقال ژن به دو دسته تقسیم می‌شوند: تحویل ناقل ویروسی و تحویل ناقل غیر ویروسی. انتقال ناقل ویروسی عمدتاً شامل آدنو{2}}ویروس مرتبط (AAV) و لنتی ویروس و غیره می‌شود که می‌تواند فرآیند عفونت ویروسی سلول‌های میزبان را شبیه‌سازی کند و به راحتی از موانع سلولی عبور کند، بنابراین بازده انتقال بالایی را به دست می‌آورد. با این حال، تحویل ناقل ویروسی نیز مشکلاتی دارد: اول، ظرفیت بسته‌بندی محدودی دارد، مثلاً حداکثر ظرفیت بسته‌بندی AAV 4.7 کیلوبایت است که نمی‌تواند توالی‌های ژنی طولانی‌تری را تحویل دهد. ثانیا، ناقل های ویروسی ممکن است باعث واکنش های ایمنی جدی، از جمله ایمنی سلولی و ایمنی هومورال شوند، که خطراتی را برای کاربردهای بالینی ایجاد می کند. در مقایسه با آن، ناقلان غیرویروسی مزایای زیادی در ایمنی و ظرفیت بارگیری دارو دارند.
ناقل‌های غیرویروسی رایج کنونی عمدتاً شامل لیپوزوم‌ها، پلیمرها، نانوذرات، اگزوزوم‌ها و غیره می‌شوند، که در میان آنها لیپوزوم‌ها وزیکول‌هایی هستند که توسط مولکول‌های آمفی‌فیلیک با قطرهای 100 نانومتر تا 1um تشکیل شده‌اند. آنها عمدتاً از فسفولیپیدها، کلسترول، لیپیدهای PEG و لیپیدهای کاتیونی تشکیل شده اند. ساختار دولایه فسفولیپیدی شبیه به غشای سلولی است و می تواند به آرامی از طریق اندوسیتوز وارد سلول ها شود. علاوه بر این، لیپوزوم‌ها همچنین می‌توانند PEG یا آنتی‌بادی‌های خاص را بر روی سطوح خود تغییر دهند تا در حین هدف قرار دادن بافت‌ها یا سلول‌های خاص، از پاکسازی ایمنی بدن فرار کنند. لیپوزوم های کاتیونی لیپوزوم هایی هستند که حاوی لیپیدهای نمک آمونیوم چهارتایی با بار مثبت هستند که بهتر می توانند با داروهای اسید نوکلئیک با بار منفی متصل شوند و پایداری سیستم تحویل را حفظ کنند. بنابراین، لیپوزوم‌ها یکی از روش‌های رایج انتقال ناقل غیرویروسی برای داروهای ژنی هستند.
با این حال، لیپوزوم‌های سنتی مشکلاتی نیز دارند: اول از همه، به دلیل گستره بزرگ قطر لیپوزوم، اگرچه این می‌تواند ظرفیت بارگیری داروی کافی را تضمین کند، زمانی که لیپوزوم‌ها از شکاف اندوتلیال عروقی (100-200 نانومتر) عبور می‌کنند، اندازه بیش از حد بزرگ این فرآیند را مختل می‌کند. علاوه بر این، پس از اینکه لیپوزوم ها از طریق اندوسیتوز وارد سلول ها می شوند و سیستم اندوزوم-لیزوزوم را تشکیل می دهند، لیپوزوم های سنتی نمی توانند به موقع لیزوزومی را کامل کنند و در نتیجه اکثر داروهای ژنی توسط لیزوزوم ها تجزیه می شوند و قادر به اعمال اثرات خود نیستند. بر اساس این کاستی‌های لیپوزوم‌های سنتی در انتقال داروهای ژنی، نانوذرات لیپیدی (LNP) توسعه یافته‌اند و به یک روش انتقال مهم به ویژه برای رساندن اسیدهای نوکلئیک به سلول‌ها و بافت‌های هدف تبدیل شده‌اند.
مقدمه ای بر سیستم حامل LNP
نانوذرات لیپیدی (LNP) نانوذراتی هستند که از مواد{0}شبیه لیپیدی و قطری معمولاً بین 10 تا 200 نانومتر تشکیل شده‌اند. در مقایسه با لیپوزوم های سنتی، آنها کوچکتر هستند و راحت تر از شکاف های اندوتلیال عروقی عبور می کنند. علاوه بر این، LNP معمولاً از لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون، فسفولیپیدهای کمکی، لیپیدهای پلی اتیلن گلیکول (PEG) و کلسترول تشکیل شده است. در میان آنها، فسفولیپیدهای کمکی و کلسترول می توانند پایداری LNP را افزایش دهند. لیپیدهای PEG به افزایش زمان گردش LNP در داخل بدن و کاهش واکنش های ایمنی کمک می کنند. این اجزا عملکردی مشابه لیپوزوم های سنتی دارند. تفاوت در لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون نهفته است، که همچنین منطقه اصلی حفاظت از ثبت اختراع برای LNP است.
همانطور که قبلا ذکر شد، لیپوزوم های کاتیونی می توانند به طور موثر اتصال با داروهای اسید نوکلئیک را حفظ کنند و کارایی تحویل داروهای اسید نوکلئیک را بهبود بخشند. با این حال، لیپوزوم‌های کاتیونی همچنین مستعد اتصال غیر اختصاصی با پروتئین‌های پلاسما با بار منفی، سلول‌های خون و غیره در گردش بدن هستند که باعث تجمع لیپوزوم‌ها می‌شود و به سرعت از بدن پاک می‌شوند (نیمه-لیپوزوم‌های کاتیونی در داخل بدن تنها 15 دقیقه است).
برای حل این مشکل، محققین نوع جدیدی از مواد لیپیدی به نام لیپیدهای یونیزپذیر ساخته اند. لیپیدهای قابل یونیزاسیون از نظر ساختار بسیار شبیه به لیپیدهای کاتیونی هستند. با در نظر گرفتن لیپید کاتیونی رایج DOTAP و لیپید قابل یونیزاسیون DODAP، تفاوت این است که DOTAP یک نمک آمونیوم چهارتایی با بار مثبت است، در حالی که DODAP یک ساختار آمین سوم است. ساختار آمین سوم می تواند pKa لیپید را بین 6-7 نگه دارد. وقتی PH کمتر از pKa باشد (در شرایط اسیدی)، لیپیدهای یونیزاسیون بار مثبت دارند.
هنگامی که PH نزدیک به pKa باشد (در شرایط خنثی)، لیپیدهای قابل یونیزاسیون خنثی هستند. این طرح می تواند به طور هوشمندانه مشکل لیپوزوم های کاتیونی را حل کند: از آنجایی که PH در گردش خون نزدیک به خنثی است، لیپیدهای قابل یونیزاسیون نیز خنثی هستند و اتصال غیر اختصاصی بین آنها و پروتئین های پلاسما یا سلول های خون به میزان قابل توجهی کاهش می یابد و نیمه عمر را افزایش می دهد. علاوه بر این، هنگامی که LNP لیپید قابل یونیزاسیون توسط سلول ها جذب می شود و وارد لیزوزوم می شود، لیپیدها یونیزه می شوند و در محیط لیزوزومی با pH 5-6 دارای بار مثبت هستند. لیپیدهای دارای بار مثبت به راحتی با غشای اندوزوم - لیزوزوم ترکیب می شوند و به لیپوزوم ها اجازه می دهند تا به سیتوپلاسم فرار کنند، اسیدهای نوکلئیک را تجزیه و آزاد کنند و در نتیجه اثرات خود را اعمال کنند. به طور خلاصه، طراحی سیستم حامل LNP شامل بهینه سازی ترکیب لیپید، اندازه ذرات، بار سطحی و پایداری برای دستیابی به تحویل ژن کارآمد است.
استراتژی بیوآنالیز LCMS برای داروهای ژن بسته بندی شده LNP-
داروهای ژنی بسته‌بندی‌شده LNP عمدتاً از پوسته LNP و خود داروی ژنی تشکیل شده‌اند. پوسته LNP عمدتاً از اجزای لیپیدی تشکیل شده است (لیپیدهای کاتیونی/یونیزاسیون حدود 30-50 درصد، لیپیدهای PEG حدود 2 درصد، کلسترول حدود 20-50 درصد، فسفولیپیدهای کمکی حدود 10-20 درصد) را تشکیل می دهند، در حالی که داروهای ژنی، عمدتاً از قطعات ژن SOD و sequNA تشکیل شده است. بر اساس آخرین مقررات NMPA و FDA [14-15]، برای کاربرد IND داروهای سیستم تحویل دارو مانند LNP، علاوه بر انجام مطالعات فارماکولوژیک و فارماکوکینتیک بر روی ماده فعال (توالی ژن)، ارزیابی ایمنی و دارویی نیز برای اجزای لیپیدی جدید که در سیستم‌های دارورسانی دارویی به بازار استفاده نشده‌اند، از جمله داروهای سیستم‌های دارورسانی دارویی و EG در بازار مورد نیاز است. لیپیدها با تغییرات ویژه در LNP.
تجزیه و تحلیل زیستی LCMS لیپیدهای LNP بر روی لیپیدهای کاتیونی/یونیزپذیر و لیپیدهای PEG تمرکز دارد. با توجه به تفاوت‌های ساختاری بین آنها، وزن مولکولی لیپیدی کاتیونی/یونیزاسیون‌پذیر عموماً در محدوده 1 کیلو دالتون است، در حالی که وزن مولکولی لیپیدی PEG می‌تواند پس از حمل گروه‌های اصلاحی به 2 تا 5 کیلو دالتون برسد، و در نتیجه تفاوت‌های زیادی در حفظ کروماتوگرافی و پاسخ طیف‌سنجی جرمی بین آنها ایجاد می‌شود. با توجه به اینکه محتوای لیپید کاتیونی/یونیزاسیون در LNP بیشتر از لیپید PEG است، تفاوت پاسخ منجر به ناتوانی در یکسان سازی موثر روش های پیش تصفیه (انتخاب حلال استخراج، تعیین فاکتور رقت) هر دو می شود. علاوه بر این، به دلیل وجود بسیاری از پیک های مزاحم در اطراف موقعیت پیک لیپید PEG، یک گرادیان جداسازی فاز مایع طولانی تر اغلب برای جداسازی موثر مورد نیاز است که نمی تواند کارایی تجزیه و تحلیل بالا را تضمین کند. بنابراین، ما به طور جداگانه روش تشخیص لیپید PEG را در بیوانالیز ایجاد می کنیم. در عین حال، لیپید کاتیونی/یونیزاسیون و لیپید PEG نیز به دلیل اجزای لیپیدی خود، مشکلات رایجی در توسعه روش دارند، مانند حلالیت ضعیف در آب، ناپایداری در ماتریکس بیولوژیکی، اتصال پروتئین به بازیابی بیش از حد، تداخل و باقیمانده چربی PEG، تغییر پایداری لیپید در ماتریس نمونه داخلی دشوار.
